荧光定量PCR仪技术及其在医学中的应用（一）

1 概述
        荧光定量多聚酶链式反应是一种新的核酸定量技术。该技术将荧光能量传递技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）应用于常规多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR仪中，从而进行定量检测。FRET即是通过受体发色团之间偶极一偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，转移效率与曲个发色团之间距离的6次幂倒数成比例。与普通定量PCR相比，荧光定量PCR仪具有可实时监测、准确性高、效率高等优点，本文综述目前国内外几种荧光定量PCR仪技术及应用。
2 荧光定量PCR 方法
2．1 TagMan
TagMan技术是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能够裂解双链DNA5 端核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的*底物是被置换了的具有又样结构的单链DNA，水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Tag酶的这种活性，设汁合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5 端标记一个荧光分子．3 端标记另一个荧光分子。其中3 端荧光分子能够吸收5 端荧光分子发出的荧光，因此，正常情况下该探针检测不到3 端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR 产物（模板）时，该针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Tag酶5 外切酶活性，将探针5 端连接的荧光分子从探
针上切割下来，破坏了两荧光分子间的FRET，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的量。其主要不足是：

 

2．2 Molecular beacon
分子信标技术（molecular beacon）也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与Tag Man探针不同的是，该探针5 和3 末端自向形成8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构，于是溶液便产生了荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低 其不足之处是：（1）杂交时探针不能*与模板结合，稳定性差；（2）探针合成时标记较复杂
近来，基于Molecular beacon的原理，人们对其进行改进，使用了一种发卡式引物（sunrise primer）．此法能将所有扩增产物均标记上荧光分子，因此荧光信号响应快。但无法区分特异和非特异扩增是致命不足 为了克服不足，人们义对其进行改进，发明了一种称为蝎状引物（scorpion primer）的荧光定馈PCR技术。该技术在引物与Molecular beacon探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至Molecular beacon分了 这样，非特异扩增产物便无荧光信号，但当有物异扩增产物时， 即可与Molecular beacon进行分了内杂交， 产生荧光信号既解决了非特异问题，又保留了响应快的特点。但仍存在杂交时， 探针不能*与模板匹配及合成复杂的问题.
2．3 Amplisensor
Amplisensor是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一种淬灭物。 探针长度不同，其中淬灭物标记探针5 端多出7个碱基（GCGTCCC）。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR仪引物的5 应有一段与长探针互补的序列． 以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针一引物复合物作为半套式引物掺入模板，从而释放淬灭探针部分，破坏了荧光能量传递，产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法主要特点：（1）采用半套式PCR扩增，提高了灵敏度，但无法区分引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，使定量准确度受到影响；（2）每次PCR扩增前，要行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本；（3）中间需加入半套式引物，增加了污染机会。
2．4 Lightcycler
Lightcycler是新近发展起来的一种定量PCR技术，该技术将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，形成发光探针和淬灭探针，发光探针的5 端与淬灭探针的3 端分别连接荧光分子。两探针设计为可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此进行定量分析。该方法淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上，因此影响扩增效率。此外，由于需合成两个较长探针，合成成本较高。